Výzkum zaměřený na úpravu krevních kmenových buněk nabízí nový přístup k produkci protilátek s širokým spektrem účinku proti infekčním onemocněním, jako je HIV, malárie a chřipka. Tato platforma by mohla mít využití také pro výrobu dalších potřebných proteinů v organismu.
Imunitní systém a protilátky
Očkování funguje na principu, kdy malý počet B buněk, rozpoznávajících antigen vakcíny, se masivně množí a dozrává v plazmatické buňky. Tyto buňky jsou schopny produkovat tisíce molekul protilátek za sekundu a přežívají v kostní dřeni po mnoho let, což zajišťuje dlouhodobou imunitu.
Většina protilátek vytvořených během infekce nebo očkování rozpoznává pouze jednu variantu povrchového proteinu viru. Pokud virus mutuje, tyto protilátky ztrácejí svou účinnost. Příkladem je virus chřipky, který mutuje rychle, což vyžaduje každoroční přeočkování. Podobná situace nastává u HIV a mnoha dalších infekcí.
Existují však vzácné případy, obvykle v důsledku dlouhodobé infekce, kdy imunitní systém člověka produkuje široce neutralizující protilátky (bNAbs). Tyto protilátky cílí na oblasti patogenu, které nemohou snadno mutovat, neboť jsou klíčové pro funkci patogenu. Přenos těchto protilátek na jinou osobu ji sice chrání před nemocí, ale jejich množství rychle klesá. Pokusy s genetickou úpravou zralých B buněk pro produkci bNAbs sice byly provedeny, ale upravené buňky spolehlivě nevytvářejí specifické dlouho žijící paměťové a plazmatické buňky, které by zajistily prodlouženou imunitu.
Nová studie z Rockefeller University, publikovaná v časopise *Science*, se zaměřila na řešení této problematiky úpravou hematopoetických kmenových a progenitorových buněk (HSPC), které jsou předchůdci různých typů krevních buněk, včetně B buněk.
Dosažení dlouhodobé imunity
Vědci vyvinuli konstrukci, která umlčuje původní sekvenci protilátky buňky a nahrazuje ji novou, jež produkuje anti-HIV bNAb. Následně ověřili, že takto upravené HSPC úspěšně diferencují v B buňky u myší. Po několika týdnech skutečně malá část B buněk příjemců produkovala zmiňované široce neutralizující protilátky.
Vzhledem k nízkému procentu upravených B buněk se zkoumalo, zda by to bylo dostatečné pro zajištění dlouhodobé imunity. Tým imunizoval myši HIV antigenem navrženým tak, aby se vázal na tuto specifickou bNAb, a sledoval hladiny protilátek v krvi po mnoho měsíců. I přes nízký podíl upravených B buněk vakcinace vedla k vysokým hladinám protilátek v krvi. Tyto hladiny klesaly pomalu po dobu více než devíti měsíců a jedna posilovací dávka je opět zvýšila. Testy potvrdily, že protilátka dokázala blokovat HIV napříč několika virovými kmeny.
Dále tým zkoumal, jaké minimální množství upravených HSPC je zapotřebí, neboť úprava HSPC je technicky náročná. Již pouhých přibližně 370 kultivovaných HSPC, z nichž bylo skutečně upraveno jen 29, stále produkovalo měřitelné hladiny protilátek. HSPC se skládají ze dvou populací: dlouhodobých hematopoetických kmenových buněk (LT-HSC), které se doživotně samoobnovují, a progenitorových buněk, které mohou produkovat krevní buňky po určitou dobu, ale nakonec se vyčerpají. Pro celoživotní terapii je nutné, aby úpravy byly v LT-HSC. Vědci potvrdili, že alespoň některé z upravených buněk byly skutečně LT-HSC.
Produkce proteinů a ochrana
Tým poté vytvořil konstrukci, která exprimuje nesouvisející fluorescenční protein spolu s protilátkou. To umožnilo sledovat upravené B buňky v těle myši. Buňky se chovaly stejně jako normální B buňky reagující na antigen: vstupovaly do zárodečných center v lymfatických uzlinách, kde se B buňky maturují, a tam se rozšiřovaly. Poté osídlily slezinu a kostní dřeň jako plazmatické buňky a takzvané třídně přepnuté paměťové B buňky, což je znakem zralé imunitní odpovědi.
To také poskytlo důkaz principu pro cílenou produkci proteinů *in vivo*: teoreticky lze takové buňky použít k produkci různých proteinů, které tělo potřebuje, po aktivaci vakcínou. Možné náplně zahrnují enzymy nebo srážecí faktory pro hemofilii. Mechanika systému, například rychlá expanze, však vytváří problémy s dávkováním, takže ne každý protein by byl vhodný.
Pro patogeny jako HIV jedna protilátka nestačí. Tým proto vytvořil konstrukci se dvěma různými anti-HIV bNAbs. Obě protilátky byly produkovány současně ve vysokých hladinách a vědci je dokázali selektivně posílit. Tým se následně zaměřil na lidské HSPC, které injekčně aplikoval myším upraveným tak, aby podporovaly vývoj lidských imunitních buněk (humanizované myši). Účinnost úpravy v lidských buňkách byla vyšší než v myších buňkách, což představuje významný translační milník.
Nakonec vědci testovali svou platformu proti dvěma dalším patogenům. Myši s upravenými HSPC s protilátkami proti malárii produkovaly sérum, které v kultuře zastavilo parazita *Plasmodium falciparum* v pronikání do lidských jaterních buněk, což je klíčový raný krok malarické infekce. Ve druhém experimentu upravili HSPC se široce neutralizující protichřipkovou protilátkou. Myši byly očkovány proti jednomu kmenu chřipky a poté napadeny zcela odlišnými, vysoce letálními kmeny, proti nimž by vakcína sama o sobě nechránila. Několikanásobně letální dávky viru zabily většinu myší v kontrolní skupině, ale žádné nebo jen málo ve studovaných skupinách.
Harald Hartweger, výzkumný asistent v laboratoři molekulární imunologie Michela Nussenzweiga, k tomu uvedl: „Naším cílem je trvale ovlivnit genom jedinou injekcí, aby tělo mohlo vytvářet proteiny zájmu. Chceme najít způsob, jak vyrobit jakýkoli protein – protilátky proti HIV, samozřejmě, ale také řešení, která řeší nedostatky proteinů a metabolická onemocnění, stejně jako protilátky k léčbě zánětlivých onemocnění nebo chřipky, nebo ty pro rakovinu. Toto je krok tímto směrem – ukazuje proveditelnost výroby život zachraňujících proteinů.“