Nová zjištění v oblasti kryoprezervace naznačují zachování neuronálních funkcí po vitrifikaci myších mozkových řezů a celého mozku. Tato studie, publikovaná v časopise Proceedings of the National Academy of Sciences, přináší poznatky z výzkumu prováděného na Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU) a Uniklinikum Erlangen v Německu.
Kryoprezervace je dlouhodobě diskutovaným tématem v medicíně i v komunitě zaměřené na dlouhověkost. Umožňuje skladování orgánů a tkání pro transplantace a v některých kruzích je vnímána jako možnost uchování života pro budoucí lékařské pokroky. Navzdory existenci firem poskytujících služby kryoprezervace a stovkám kryoprezervovaných jedinců, spolehlivé zmrazení a následné oživení lidského těla nebo mozku dosud nebylo prokázáno. V nedávné době však bylo dosaženo pokroku s orgány, jako jsou ledviny potkanů, játra a srdce, které byly úspěšně kryoprezervovány a funkčně obnoveny. Dosud však nebylo demonstrováno obnovení funkce mozku po kryoprezervaci.
Hlavní překážkou kryoprezervace jakékoli tkáně je tvorba ledu. Při zmrazení voda expanduje a krystaly ledu mohou mechanicky poškozovat buněčné membrány, synaptická spojení a celkovou architekturu tkáně. Tradiční metody zmrazování dospělé mozkové tkáně opakovaně selhaly v zachování synaptické funkce. Dr. Alexander German z Oddělení molekulární neurologie na Uniklinikum Erlangen vysvětluje, že tvorba ledových krystalů je důvodem, proč je extrémní chlad obvykle tak škodlivý pro živé bytosti, neboť mohou mechanicky poškodit buňky a zničit citlivou nanostrukturu tkáně.
Řešením může být technika nazvaná vitrifikace (z latinského vitro, což znamená „sklo“). Místo toho, aby se voda změnila v krystaly, je většina tkáňové vody nahrazena kryoprotektivními látkami (CPA), jako je dimethylsulfoxid, ethylenglykol a formamid. Při dostatečně vysoké koncentraci a rychlém ochlazení se vodní fáze mění spíše na sklovitou než na led, což zabraňuje mechanickému narušení. Vitrifikace v podstatě zastavuje všechny molekulární procesy a uchovává aktuální stav tkáně prakticky neomezeně.
Integrita struktury a funkce
Výzkumný tým vyvinul vlastní vitrifikační protokol a testoval jej nejprve na řezech myšího mozku. Po vitrifikaci byly řezy uchovávány v kapalném dusíku při -150 °C po dobu 10 minut až 7 dnů a poté byly ohřáty. Úpravou složení vitrifikačního roztoku se týmu podařilo zcela zabránit krystalizaci.
Dalším krokem bylo zjistit, zda tyto řezy byly skutečně živé a funkční. Pro ověření funkce mitochondrií autoři měřili rychlost spotřeby kyslíku v CA1 regionu hippocampu. Při optimální koncentraci CPA zjistili 22% snížení bazální respirace ve srovnání s čerstvými kontrolami. Celkový pokles mitochondriální funkce byl však způsoben spíše toxicitou CPA než samotným procesem vitrifikace/ohřátí, což bylo prokázáno, když výzkumníci použili zatížení a vymytí CPA bez vitrifikace/ohřátí. To naznačuje, že bezpečnější koktejly CPA by mohly výsledky dále zlepšit.
Mitochondriální respirace je hrubým měřítkem životaschopnosti, a proto bylo nutné zjistit, zda přežije jemná struktura – synapsy, dendrity, membrány. Elektronová mikroskopie ultratenkých řezů z CA1 regionu odhalila jasné membrány a intaktní neuronální a synaptické struktury. Kvantitativní analýza hustoty a délky dendritických trnů neprokázala žádné rozdíly mezi kontrolními a post-vitrifikačními řezy.
Synaptická struktura se zdála být neporušená, bylo však třeba ověřit její funkci. Tým zjistil, že základní synaptický přenos byl zachován, avšak mírně oslaben. Krátkodobá plasticita (STP) – krátké, přechodné změny synaptické síly – byla v po-vitrifikačních řezech oslabena, nikoli však kvůli dostupnosti neurotransmiterů, která byla shodná ve všech třech skupinách.
Klíčovým testem byla dlouhodobá potenciace (LTP), aktivitou závislé, perzistentní posílení synaptických spojení, široce považované za buněčný mechanismus učení a paměti. Pokud LTP přežije vitrifikaci, znamená to, že molekulární mechanismy pro kódování nových vzpomínek zůstávají funkční. Kryoprezervované řezy spolehlivě produkovaly LTP, a u jednoho konkrétního typu synapse byla dokonce silnější než před vitrifikací. Jednobuněčná excitabilita byla rovněž z velké části zachována, ačkoli se to poněkud lišilo napříč buněčnými podtypy.
Dosažení vitrifikace celého mozku
Poté co autoři potvrdili přežití mozkových řezů po vitrifikaci, rozšířili experiment na celý myší mozek. To představuje podstatně složitější problém, protože CPA musí být dodávány cévním systémem, což znamená překonání hematoencefalické bariéry. To způsobilo závažnou komplikaci: když byl roztok CPA perfundován cévním systémem, voda opouštěla mozek rychleji, než CPA vstupovala, což vedlo ke katastrofální dehydrataci a fyzickému zmenšení mozku. Nedokonalým řešením, které tým našel, byla částečná rehydratace mezi pulsy CPA.
Po kraniektomii byly mozky vitrifikovány in situ, uchovávány při -140 °C po dobu 1 až 8 dnů, ohřáty a CPA byly vymyty. Úspěšnost však byla nižší: pouze jedna ze tří iterací konečného protokolu vyprodukovala tkáň vhodnou pro fyziologické hodnocení. Dobrou zprávou je, že většina funkčních metrik byla po ohřátí zachována, ačkoli tým analyzoval pouze ten podtyp neuronů, který si v experimentech s řezy vedl nejlépe – granulární buňky v dentate gyrus (DG) oblasti hippocampu. V současné době tak není známo, zda se stejně dobře dařilo i jiným neuronům.
Ačkoli cesta k úspěšné kryoprezervaci celého organismu nebo velkého mozku je stále dlouhá, jedná se o povzbudivou studii typu „proof-of-concept“. Dr. German vyjádřil naději v potenciální aplikace tohoto objevu, například pro vesmírné cestování nebo pro osoby trpící v současnosti neléčitelnou nemocí, s tím, že v budoucnu by mohla existovat léčebná možnost, která by postiženým pomohla.
Literatura
[1] German, A., Akdaş, E. Y., Flügel-Koch, C., Erterek, E., Frischknecht, R., Fejtova, A., … & Zheng, F. (2026). Functional recovery of the adult murine hippocampus after cryopreservation by vitrification. Proceedings of the National Academy of Sciences, 123(10), e2516848123.
[2] Han, Z., Rao, J. S., Gangwar, L., Namsrai, B. E., Pasek-Allen, J. L., Etheridge, M. L., … & Finger, E. B. (2023). Vitrification and nanowarming enable long-term organ cryopreservation and life-sustaining kidney transplantation in a rat model. Nature communications, 14(1), 3407.
[3] Sharma, A., Lee, C. Y., Namsrai, B. E., Han, Z., Tobolt, D., Rao, J. S., … & Finger, E. B. (2023). Cryopreservation of whole rat livers by vitrification and nanowarming. Annals of biomedical engineering, 51(3), 566-577.
[4] Chiu-Lam, A., Staples, E., Pepine, C. J., & Rinaldi, C. (2021). Perfusion, cryopreservation, and nanowarming of whole hearts using colloidally stable magnetic cryopreservation agent solutions. Science advances, 7(2), eabe3005.