Převratný pokrok v genové editaci: Oprava mutací mitochondriální DNA
Nová studie ukazuje, že inovativní nástroje pro genovou editaci dokážou opravit choroboplodné mutace v mitochondriální DNA (mtDNA) v primárních lidských buňkách. Tento objev představuje významný krok vpřed v oblasti léčby mitochondriálních onemocnění a potenciálně i v boji proti stárnutí.
Potřeba menších editačních nástrojů
Nástroje pro editaci genomu, jako je CRISPR, byly jedním z největších vědeckých průlomů tohoto století. Jsou však vhodné pouze pro editaci jaderné DNA. Mitochondrie, organely produkující energii, mají svou vlastní kruhovou DNA (mtDNA), která se nachází uvnitř každé mitochondrie a kóduje řadu esenciálních proteinů. Mutace v mtDNA způsobují několik onemocnění a jsou také spojeny se stárnutím. Donedávna neexistoval snadný způsob, jak editovat mtDNA, protože nástroje založené na CRISPR jsou příliš velké na to, aby mohly vstoupit do mitochondrií.
Situace se začala měnit zavedením menších editačních nástrojů, ale je zapotřebí dalšího výzkumu k jejich testování a zdokonalení. V nové studii publikované v PLOS Biology vědci z University Medical Center Utrecht v Nizozemsku použili cytosinovou bazickou editoru odvozenou od toxinu A (DdCBE), spárovanou s vodicími proteiny nazvanými TALE, k vývoji in vitro modelů onemocnění a posouzení terapeutických strategií pro mitochondriální onemocnění v primárních lidských buňkách.
Vytvoření modelu onemocnění
Nejprve tým použil DdCBE k zavedení mutace se ztrátou funkce (m.15150G>A) do organoidů odvozených z lidských primárních dospělých jaterních kmenových buněk. Tato konkrétní mutace zatím nebyla spojena s žádnou známou chorobou, ale jiné mutace ve stejném genu (MT-CYB) ano. Vědci uvádějí, že jejich editační nástroj úspěšně zavedl mutaci.
Jedná se o důležitý krok při vytváření modelů mitochondriálních onemocnění, aby je bylo možné studovat a léčit. „Mitochondriální dysfunkce a změny mtDNA jsou spojeny s několika patologiemi spojenými s věkem, nicméně naše schopnost porozumět základním mechanismům je omezena nedostatkem vhodných modelů,“ uvedla Dr. Amutha Boominathan, hlavní výzkumná pracovnice z Lifespan Research Institute, která se této studie neúčastnila.
Zatímco buňka má pouze dvě kopie jaderné DNA, jednu od každého rodiče, v každé buňce mohou být stovky tisíc mitochondrií, každá s vlastní kruhovou DNA. Proto je třeba editaci zavést do co největšího počtu těchto kopií. Přítomnost více než jednoho typu mtDNA v jediné buňce se nazývá heteroplazmie.
Když vědci zavedli patogenní mutaci do zdravých jaterních organoidů, nevytvořili buňky, které byly 100% mutované. Místo toho izolací a pěstováním jednotlivých buněk generovali kolekci linií organoidů s širokým rozsahem úrovní heteroplazmie (od 0 % do 80 % mutovaných). To jim umožnilo studovat účinky různých úrovní na závažnost onemocnění, protože přirozeně se vyskytující onemocnění DNA se také projevují až po překročení určitého prahu heteroplazmie.
Oprava mutace a výzvy
Dalším krokem bylo pokusit se opravit známou škodlivou mutaci. Ve fibroblastech od pacienta systém DdCBE úspěšně korigoval patogenní mutaci m.4291T>C, která je spojena se Gitelmanovým syndromem, skupinou dědičných poruch ledvin.
Heteroplazmie zůstala výzvou: když vědci pěstovali kolonie z jednotlivých editovaných buněk, zjistili široký rozsah úrovní korekce DNA. Pozitivní je, že tyto úrovně zůstaly stabilní po dobu 50 dnů sledování a dokonce se mírně zvýšily, což ukazuje, že opravené mitochondrie byly zdravé a neměly v buňce selektivní nevýhodu.
V buněčných liniích s vysokou úrovní korekce (76 % a 81 %) byl mitochondriální membránový potenciál úspěšně obnoven na úroveň zdravých kontrolních buněk, což naznačuje funkční záchranu. V linii s nízkou korekcí (35 %) nedošlo k žádnému zlepšení.
Výsledky pro celkovou produkci energie byly skromnější a nekonzistentní. Zatímco v některých experimentech bylo pozorováno mírné zlepšení, efekt nebyl tak silný ani spolehlivý jako obnova membránového potenciálu. Autoři poznamenávají, že to vyžaduje další studium.
Nové metody dodávání editorů
Zpočátku tým používal osvědčenou metodu dodávání: DNA přenášená virovými vektory. V pozdějších experimentech však ukázali, že lepší metodou bylo dodávat editor jako modifikovanou RNA (modRNA). Modifikace zahrnovaly úpravu RNA nukleotidů pro větší stabilitu a ochranu molekuly před detekcí imunitním systémem. Ve srovnání s dodáváním DNA prokázala modRNA mnohem vyšší účinnost a menší cytotoxicitu.
Modifikované molekuly RNA byly dodávány pomocí lipidových nanočástic (LNP). Jedná se o stejnou nejmodernější technologii používanou k dodávání mRNA v případě vakcín proti COVID-19, považovanou za nejpokročilejší nevirový systém pro in vivo dodávání.
„Přizpůsobení nástrojů pro přesnou editaci DNA, jako jsou bazické editory, k cílení na mitochondriální genom má významný potenciál pro modelování i léčbu onemocnění spojených s mutacemi mitochondriální DNA (mtDNA),“ uvedla Dr. Boominathan. „Tento přístup však čelí několika výzvám, včetně vysokého počtu editací požadovaných na buňku (kvůli velkému počtu kopií mtDNA), dosažení homogenní editace napříč buněčnými populacemi a minimalizace mimocílových účinků. V této studii autoři úspěšně vygenerovali patogenní mutaci v jaterních organoidech a korigovali mutaci m.4291T>C ve fibroblastech odvozených od pacientů. Nicméně přetrvávají omezení, jako je variabilita v účinnosti editace – jak v rozsahu, tak v uniformitě editací – a vyžadují další optimalizaci.“